W 1601 na synodzie diecezjalnym wydano dekret o powstaniu seminarium. Z kolei 20 grudnia 1602 kard. Bernard Maciejowski podejmuje decyzję o erygowaniu seminarium. Początkowo alumni mieszkali na Wawelu, ale z czasem wyodrębniły się trzy seminaria: prowadzone przez księży misjonarzy, akademickie i zamkowe. Jednak 28 września 1901 powstało nowe seminarium diecezjalne przy ul. Podzamcze. Zostało powołane przez biskupa krakowskiego kardynała Jana Duklana Puzynę, którego staraniem wzniesiono w latach 1899–1902 neogotycki gmach według projektu Gabriela Niewiadomskiego. W roku 1954 diecezja oddała na użytkowanie seminarium budynek przy ul. Piłsudskiego 4 (wówczas Manifestu Lipcowego 4). W kolejnych latach dokonano wielu remontów i modernizacji tak, aby 17 listopada 2001 uroczyście świętować 400-lecie seminarium, które służy wielu pokoleniom kapłanów. 13 sierpnia 1991 seminarium odwiedził papież Jan Paweł II.